Etapa II/2022 a proiectului 197TE/MAGNIFICENT si-a propus investigarea diferentierii celulelor stem din tesut adipos (hASC) pe cale neuronala asistata de materiale GMG, GM si GG dezvoltate in etapa I a proiectului si evaluarea efectului nanoparticulelor magnetice (MNP) si a oxidului de grafena (GO) asupra acestei diferentieri.

• A fost identificat materialul GMG cu continut de nanospecii (atat de GO, cat si MNP) ca fiind cel mai optim compozit pentru sustinerea procesului de diferentiere pe cale neuronala a celulelor stem.

• Pe materialele GM, GG si GMG celulele induse sa diferentieze catre celule neuron-like au exprimat makeri neuronali, precum βIII tubulina, MAP2 (microtubule associated protein 2), NeuN (Neuronal Nuclear Antigen), GFAP (glial fibrillary acidic protein) atat la nivel genic, cat si proteic, validand astfel procesul de diferentiere pe cale neuronala a hASCs (act 2.5, act 2.7, act 2.8).

• In plus, a fost evidentiata activarea cailor de semnalizare specifice in diferentierea neuronala, semnalizarea prin cAMP, prin identificarea expresiei PKA si a proteinei OPA1 in mitocondriile celulelor in curs de diferentiere (act 2.2). 

• In vederea aprofundarii controlului procesului de diferentiere neurogenic, a fost analizat profilului de expresie al ARN non-codant in contextul diferentierii celulelor stem in contact cu materialele GM, GG si GMG. Prin analiza datelor de qPCR a fost evidentiata supraexprimarea miR-124a, miR-125a, miR-128a si miR-128b pe GMG (act. 2.1), miR-128a, miR-128b si miR-218 pe GM (act 2.6) si miR-9, miR-124a, miR-125a, miR-136 si miR-138 pe GG (act 2.9), toate aceste molecule miR fiind cunoscute din literatura ca fiind implicate in controlul procesului de diferentiere pe cale neuronala sau in formarea tesutului nervos. Aceste activitati au confirmat activarea diferentierii neurogenice la nivel genic si post-transcriptional in celulele induse in contact cu materialele dezvoltate in acest proiect.

• In studiul influentei MNP si magnetismului asupra procesului de diferentiere a celulelor stem pe cale neuronala s-au obtinut urmatoarele: a fost observata adoptarea unei morfologii alungite, fusiforme a hASCs cultivate pe materiale GM, comparativ cu materialul pe bază de gelatină (G) folosit pe post de control. Incorporarea MNPs în materiale pe bază de gelatină influențează morfologia celulară prin schimbări apărute la nivelul arhitecturii citoscheletale și modului de atașare la substrat. A fost evidentiat complexul LINC prin microscopie de fluorescenta, precum si modificari la nivelul laminelor nucleare, demostrand astfel efectul MNP activate atat asupra modificarilor la nivelul citoscheletului, cat si a morfologiei nucleare si a fibrelor de cromatina (act 2.3). Aceste modificari la nivel morfologic au fost confirmate si prin modificări epigenetice apărute la nivelul histonelor ca urmare a interacțiunii hASCs cu materiale GM. Pentru histona H3 a fost inregistrat un nivel crescut al metilării resturilor de lizină din pozițiile 9 (H3K9me1) și 27 (H3K27me1, H3K27me2 și H3K27me3), iar in cazul histonei H4 a fost înregistrat un nivel crescut al metilării duble a restului de arginină 3 (H4R3m2), precum și mono și dubla metilare a restului de lizină 20 (H4K20m1, H4K20m2) (act. 2.4). Toate aceste rezultate au indicat un efect deosebit de interesat al MNP si magnetismului asupra proceselor de diferentiere, care necesita aprofundare in viitoare activitati de cercetare.

• Studiul efectului GO asupra desfasurarii proceslor de diferentiere neurogenica a relevat un efect pozitiv al 0.5% GO incorporat in materialele pe baza de gelatina (GG), care a favorizat cresterea expresiei la nivel genic si proteic a markerilor de diferentiere specifici (act 2.7), a indus activarea speciilor miR-9, miR-124a, miR-125a, miR-136 si miR-138 importante pentru controlul procesului de diferentiere (act 2.9).

• Datele obtinute in cadrul etapei a II-a au fost analizate cu softuri de specialitate si au fost integrate in contextul diferentierii pe cale neuronala a celulelor stem si cu datele din literatura de specialitate (act 2.10). Rezultatele obtinute au fost diseminate prin cinci lucrari in cadrul unor conferinte de specialitate si prin submiterea a doua articole catre jurnale indexate ISI.